ニック翻訳とプライマーエクステンションの違い

分子生物学において、ギャップ変換とプライマー伸長は重要な技術である。ギャップ変換とプライマー伸長法の主な違いは、ギャップ変換のプロセスでは他のハイブリダイゼーション技術に用いる標識プローブを生成し、プライマー伸長法では混合物から特定のRNA配列を同定してmRNAの発現に関する情報を明らかにする点である。どちらも非常に重要な技術であり、通常、分子研究所の中で行われている。

Contents1. 概要と主な違い2. ニック・トランスレーション3. What is it.Primer Extensionとは4.比較-Nick翻訳とPrimer Extensionの比較5.まとめ

ニック・トランスレーションは何ですか？

ギャップ変換は、ブロッティング、in situハイブリダイゼーション、蛍光in situハイブリダイゼーションなどの様々な分子生物学的手法の準備に使用される重要なDNA標識法です。DNAプローブは、特定のDNAまたはRNA配列を識別するために使用されます。標識プローブを用いることで、複雑な核酸混合物から特定の断片を標識または可視化することができる。そのため、様々な技術で標識プローブを調製し、使用されています。ギャップ変換は、DNAase1とDNA polymerase1という酵素を使って、標識プローブを生成する方法です。

ギャップ変換は、DNase-1という酵素の活性から始まる。 DNase-1は、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断することにより、二本鎖DNAのリン酸骨格にへこみを導入する。DNAポリメラーゼ1の5′-3′核酸エキソヌクレアーゼ活性が、ニックからDNA鎖の3′方向に向かってヌクレオチドを除去する。ポリメラーゼ1のヌクレオチドを同時に添加し、ポリメラーゼ活性を置き換えます。ヌクレオチドが標識されている場合、そのヌクレオチドは標識されたヌクレオチドに置き換えられ、DNAが認識されるように標識される。この新しく合成された標識DNAは、分子生物学における様々なハイブリダイゼーション反応のプローブとして使用することができる。

図01：銘板翻訳のプロセス

プライマーエクステンションは何ですか？

プライマー伸長法は、RNA混合物から特定のRNA配列を見つけ出し、mRNA転写産物の5'末端を特定する技術である。また、RNAの構造や発現の研究にも利用されています。プライマー伸長は、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドを用いて行われる。ラベル付きプライマーを使用する場合、cDNA合成に使用するヌクレオチドはラベル付きではありません。この手法にはいくつかの段階があります。標識されたオリゴヌクレオチドプライマーは、特定のRNA配列のcDNAを合成するために必要な成分とともに混合物に加えられる。プライマーは、相補的な配列の混合物にアニーリングする。プライマーがアニーリングした配列を鋳型として、逆転写酵素がRNA配列の相補的DNA（cDNA）を合成する。プライマーのアニーリングと逆転写は、サンプルに特定のRNA配列が存在する場合にのみ行われます。最後に変性ゲル電気泳動を行うと、RNAの配列の大きさを知ることができる。また、プライマー伸長により、mRNA（転写開始点）配列の+1塩基を容易に見つけることができます。過剰なプライマーを使用した場合、サンプル中に存在するmRNAの量を本法で定量することが可能です。

図02：プライマーエクステンション

ニック翻訳とプライマーエクステンションの違い

概要 - ニック翻訳 vs. プライマーエクステンション

ギャップ変換は、DNAase 1と大腸菌のDNA polymerase 1の酵素活性を利用した標識プローブの合成方法です。これは、異なるハイブリダイゼーション技術に先立ち、実験室で使用されるin vitroの方法です。ニック変換の際、DNAポリメラーゼ1の5'-3'核酸エキソヌクレアーゼ活性がニックの前のヌクレオチドを除去し、DNAポリメラーゼ1のポリメラーゼ活性が除去したヌクレオチドとニックの後ろの標識ヌクレオチドを置き換えます。プライマー伸長法は、混合物から特定のRNA転写物を検出し、目的のRNAのサイズと量を定量する方法である。ニックとプライマーの違いは、翻訳にあります。

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