oligo-dT/载体组合主要用于通过亲和层析技术从总RNA中纯化mRNA。从总RNA中分离mRNA的方法主要有两种，一种是根据细胞的类型；即直接法和减法。本文对这两种方法进行了说明。

信使RNA（mRNA）是由一系列RNA核苷酸组成的转录产物。它将基因中的信息从细胞核传递到细胞质，以合成蛋白质。从一个特定的细胞系中分离RNA得到总RNA，由rRNAs、tRNAs和mRNAs组成。因此，在研究细胞系转录组的过程中，mRNA应该从总RNA的混合物中分离出来。mRNA的独特性质，如mRNA分子3′端存在poly（a）尾，用于分离。由于寡dT分子与poly（A）尾互补，mRNA可以从总RNA的混合物中分离出来。

覆盖的关键领域

1.什么是mRNA–定义、结构、功能2.总RNA–mRNA、rRNA、tRNA的组成是什么3.如何从总RNA中分离mRNA–使用寡核苷酸/载体分子

关键词：亲和层析，信使RNA（mRNA），减法，寡核苷酸，聚（A）尾，总RNA

什么是信使核糖核酸(mrna)？

mRNA是一个蛋白质编码基因的转录本。它是在真核生物的细胞核内产生的，并将特定蛋白质的产生信息传送到细胞质中。在翻译过程中，它被转化为蛋白质的氨基酸序列，并在核糖体的辅助下被翻译成蛋白质。真核生物转录产生的原转录子称为premrna。

Figure 1: mRNA Structure

在转录后修饰过程中，产生了成熟的mRNA分子，其特征有5′cap和poly（a）尾。一个特定生物体的总mRNA被称为转录体。

什么是总rna的组成(the composition of total rna)？

RNA分离的结果称为总RNA。它由细胞产生的所有三种主要类型的RNA组成。它们是mRNA、tRNA和rRNA。tRNA和rRNA都有助于翻译。真核mRNA的大小为0.5-20kb。转移RNA（tRNA）在翻译过程中产生相应的氨基酸。它有76-90个碱基对长，由反密码子区组成，反密码子区与mRNA上的特定密码子互补。核糖体RNA（rRNA）是核糖体的组成部分。一些人类的rrna有5kb长。

总RNA的90%以上由tRNA和rRNA组成。mRNA仅占总RNA的1-5%。一个典型的哺乳动物细胞可能由每个细胞大约500000个mRNA分子组成。特定类型的mRNA的数量可以是每个细胞15-20000个拷贝。

如何从总rna中分离mrna

许多分子生物学技术如cDNA文库构建、微阵列制备的样品制备、弱表达基因的Northern印迹分析等都需要高质量的mRNA。从总RNA中分离mRNA的方法主要有两种：直接法和减法。

mrna直接分离法

从真核总RNA中分离成熟mRNA的原理是利用寡核苷酸（寡核苷酸）对多糖基化mRNA进行亲和选择/亲和层析，这是对聚（A）尾的补充。这是可能的，因为在另外两种RNA类型：tRNA和rRNA中没有聚（a）尾。

mRNA由30-200个腺嘌呤核苷酸组成。用oligo-dT/载体组合填充亲和柱从总RNA中分离mRNA。oligo-dT/载体组合可以是纤维素结合的oligo-dT、具有链霉亲和素偶联磁珠的生物素化的oligo-dT或oligo-dT偶联的聚苯乙烯乳胶珠。所有实验条件均应在无RNA酶的条件下进行，以防止RNA酶解。

Figure 2: Affinity Chromatography

总RNA应溶解在高盐缓冲液中，并短暂加热至65-70℃°C破坏RNA的二级结构。RNA分离的条件因市售mRNA分离试剂盒而异。然而，poly（A）-RNA或mRNA的制备分为三个步骤。

1. poly（A）-RNA与载体连接的寡核苷酸分子的杂交
2. 游离RNA的洗涤
3. 低严格条件下寡核苷酸/载体组合中poly（A）-RNA的洗脱

mrna分离的减法

基于Oligo-dT的mRNA纯化仅产生具有poly（a）尾或成熟真核mRNA的mRNA。因此，另一种称为减法的方法可用于纯化不具有聚（a）尾的mRNA。该方法可用于酵母mRNA和细菌总RNA的分离。它也可用于从真核细胞中分离未成熟型mRNA和成熟型mRNA。它通过从总RNA中去除大的核糖体RNA来实现转录组的富集。ThermoFisher Scientific的RiboMinusTM转录组分离试剂盒采用三个步骤从酵母和细菌总RNA中高效纯化mRNA。

1. 总RNA与rRNA序列特**5′生物素标记寡核苷酸探针的杂交
2. 链霉亲和素磁珠去除rRNA/5′-生物素标记探针复合物的研究
3. 杂质的纯化和mRNA的洗脱。

结论

总RNA由三种主要类型的RNA组成：mRNA、rRNA和tRNA。从总RNA中纯化mRNA对于分析特定生物体的转录组是必不可少的。纯化的方法是基于mRNA的类型。利用oligo-dT亲和层析技术可以分离出含有poly（a）尾的真核mRNA。通过从总RNA中去除大量rRNA，可以从酵母和细菌细胞中分离出不成熟的真核mRNA和mRNA。

引用

1.“mRNA提取”。Thermo Fisher Science，可在这里提供。2.“RNA类型提取RNA”  Thermo Fisher Scientific，此处提供。 2.“RNA类型提取RNA”  Thermo Fisher科学公司，