引物是体内外DNA扩增的重要组成部分。在体内，这种酶，DNA聚合酶需要一个启动DNA复制的引物。在体外，引物主要用于启动聚合酶链反应（PCR）。其他一些技术包括测序、克隆、定点突变等都需要引物。因此，设计用于体外技术的引物变得非常简单，但对分子生物学家来说却是一个具有挑战性的过程。因此，本文讨论了PCR和测序引物设计的基本原则。

覆盖的关键领域

1.什么是引物-定义、类型、作用2.引物在PCR中如何工作-DNA的特征、PCR的过程3.如何**PCR引物-设计PCR引物的基本规则4.如何设计测序引物-测序引物的特征

关键词：DNA合成，正向引物，长度，熔化温度，PCR，反向引物，测序引物

什么是底漆(a primer)？

引物是DNA或RNA的短链，作为DNA合成的起点。催化DNA复制的酶能够将核苷酸加到现有的3′端。因此，引物为DNA合成奠定了基础。RNA引物在细胞内用于DNA聚合酶启动DNA复制。然而，人工合成的DNA引物可用于DNA的扩增，主要通过PCR等技术。PCR中使用了两种类型的引物，它们被称为正向引物和反向引物。在PCR过程中，通过正向和反向引物在基因组DNA的特定DNA序列的两侧**，可以产生数百万份所需的DN**段。特定DNA序列两侧的正向和反向引物如图1所示。

Figure 1: Forward and Reverse Primers

引物在pcr中是如何工作的

DNA是一种分子，有两条链连在一起。碱基对模式是互补的，每一个在两股。这两条链通过互补氮基之间的氢键连接在一起。此外，每条线都有自己的方向性。一股具有5′至3′方向性，而另一股具有3′至5′方向性。因此，两股是反平行的。5′-3′方向的链称为正义链，3′-5′方向的链称为反义链。在PCR过程中，每两条链应单独合成。

PCR的三个步骤是变性、退火和延伸。在变性过程中，加热到95℃破坏氢键，使两股DNA分开°C.正向引物与正义链结合，而反向引物与反义链结合。当温度从95℃下降时，底漆退火°C至50-60°C.因此，这两条链可以在Taq聚合酶的帮助下同时合成。正、反义链均在5′至3′方向扩增。由于PCR是指数反应，因此这三个步骤以25-35个周期重复。在每个周期中，正向和反向引物都被用来产生大约235份所需的DN**段。引物在PCR中的作用如图2所示。

Figure 2:  PCR

pcr引物的制备

为了在基因组中扩增一个特定的DN**段，该特定的DN**段的两侧应该有正向和反向引物。因此，这两个引物应该是互补的序列两侧的DN**段。成功设计PCR引物的基本原则如下。

1. 正向和反向底漆的方向应为5′至3′。
2. 每个引物的长度应该在18到25个核苷酸之间。
3. 引物的GC含量在40%到60%之间，引物3'端的C或G的存在可能促进结合。
4. 底漆对的熔化温度和Tm（一半底漆已退火到模板的温度）应相似且高于60°C.最大差值应为5°C.
5. 引物的3′端应与模板DNA完全匹配。
6. 底漆3′端的最后5个碱基中至少应有2G或C碱基（GC夹钳）。GC钳促进与靶序列的强结合。
7. 带有5-6个核苷酸的限制性位点可以添加到引物的5'端。
8. 在引物序列中应避免二核苷酸重复（ATATATAT）或同一核苷酸重复4次以上（ACCCC）。这会导致误判。
9. 应避免引物内同源性或引物的二级结构。在正向和反向引物中应避免引物间同源或互补序列。这两种情况都可能形成自二聚体或引物二聚体。
10. 这个Δ二聚体分析的G值应在0到−9千卡/摩尔。

许多在线工具可用于引物设计的简易性，如引物3、引物X、NetPrimer、DNAstrar等。所设计引物的特**可通过NCBI-primer-BLAST或UCSC-in-silico-PCR等工具确定。

Figure 3: Primer 3 Interface

如何设计测序引物

测序引物是短的DNA链，就像PCR引物一样。然而，PCR引物被设计用于扩增特定的DN**段，而测序引物则被用来通过PCR揭示扩增的DN**段的核苷酸序列。与PCR引物不同的是，只要目标序列长度小于500bp，就可以使用单一引物进行测序。例如，PCR的前向引物可用于测序，仅扩增有义链。此外，测序反应中耐受的错配程度高于PCR。一般来说，PCR引物与目标序列是互补的。然而，有些测序引物与目的序列无关。它们被称为通用引物。通用引物如T7或SP6退火到携带目标序列的载体。它们既可以用于多种载体，也可用于各种类型的DN**段。

结论

引物用于PCR和测序以启动DNA合成。PCR引物可分为正向引物和反向引物。正向引物退火到正链，反向引物退火到反义链。在测序中，可以使用正向或反向引物来扩增目标。在设计引物时，应考虑引物长度、Tm、GC含量等因素。许多在线工具可用于设计特定序列的引物。

引用

1.“引物设计：有效过程的技巧”，基因组编译器公司，2015年11月3日，可在这里获得。2、“测序引物和引物设计”，测序引物和引物设计，卡尔加里大学，可在这里。 2、“测序引物和引物设计”，测序引物和引物设计，卡尔加里大学，