反相色谱法和疏水相互作用色谱法的主要区别在于反相色谱法（RPC）使用了更疏水的介质，这导致了更强的相互作用，而疏水相互作用色谱（HIC）使用了一个较低的疏水性介质相比，在反相色谱介质。

反相色谱法和疏水相互作用色谱法是两种依赖于色谱介质疏水表面与生物分子表面疏水斑块相互作用的色谱技术。

覆盖的关键领域

1.什么是反相色谱-定义、步骤、应用2.疏水相互作用色谱-定义、步骤，应用3.反相色谱和疏水相互作用色谱之间有什么相似之处——共同特征概述4.反相色谱和疏水相互作用色谱之间的区别是什么？关键差异比较

关键术语

疏水作用色谱法，HIC，介质，反相色谱法，RPC

什么是反相色谱法(reverse phase chromatography)？

反相色谱（RPC）是一种用于纯化和分析蛋白质、多肽和寡核苷酸等生物分子的色谱技术。它提供了高分辨率的分离，是理想的肽图谱和纯度检查。RPC更常用于多肽和寡核苷酸的最终抛光。

两种主要类型的疏水性介质可用作固定相：覆盖碳链的二氧化硅珠或**的疏水性聚合物。将疏水性介质以填充床的形式填充到柱上，并在其上施加样品。离子配对剂如三氟乙酸（TFA）可加入到流动相中以增强疏水相互作用的形成。开始时使用5%乙腈等有机改性剂，随着乙腈含量的增加，可以开始洗脱。

Figure 1: Reverse Phase Chromatography Theory

疏水性较低/极性较强的生物分子将首先洗脱，而疏水性较强的分子将随后洗脱。RPC是分辨率最高的色谱技术。

什么是疏水作用色谱法(hydrophobic interaction chromatography)？

疏水相互作用色谱（HIC）是另一种在中等条件下基于疏水性的生物分子分离技术。当样品在初始浓缩和净化过程中必须经过硫酸铵沉淀时，这是一种理想的蛋白质纯化技术。硫酸铵沉淀过程中盐含量的升高增加了疏水组分之间的相互作用。

Figure 2: Effect of High Salt Concentration on Hydrophobic Interacti***

HIC的疏水性介质是一种惰性的球形颗粒基质，表面涂有含烷基或芳基的配体。疏水相互作用发生在中等高盐浓度下（通常为1–2 M硫酸铵或3 M NaCl）。起始缓冲液确保相关蛋白质与培养基结合，同时将杂质洗掉。洗脱缓冲液含低盐浓度，削弱了蛋白质与固定相的相互作用。

反相色谱与疏水作用色谱的相似性

• 基于生物分子的疏水性，反相色谱法和疏水作用色谱法是分离生物分子的两种方法。
• 两种技术的流动相都是水或有机溶剂。
• 它们使用填充床色谱柱。
• 起始缓冲区确保所需分子与色谱柱结合。
• 疏水性最低的分子可以先洗脱，而疏水性较强的分子可以稍后洗脱。
• 最后的洗涤步骤是洗脱结合最紧密的分子。
• 两种技术的分辨率是选择性（峰之间的分离度）的组合，  技术的效率（产生窄对称峰的能力）、样品的质量和保留时间。

反相色谱法(reverse phase chromatography)和疏水作用色谱法(hydrophobic interaction chromatography)的区别

定义

反相色谱（RPC）是指基于混合物中分子疏水性的最高分辨率分离技术，而疏水相互作用色谱（HIC）是指基于疏水性的分离技术，但操作条件相对温和。

疏水性

RPC在更疏水的条件下工作，而HIC在相对温和的疏水条件下工作。

互动

反相色谱法使分子与固定相之间的相互作用更强，而HIC使固定相与分子之间的相互作用达到中等程度。

疏水介质

RPC使用覆盖有碳链的二氧化硅珠或**的疏水聚合物，而HIC使用涂有含烷基或芳基配体的球形粒子的惰性基质。

启动缓冲区

RPC中的起始缓冲液使用三氟乙酸（TFA），HIC的起始缓冲液使用中等高盐浓度。

洗脱

随着乙腈含量的增加，RPC开始洗脱，而盐浓度的降低，HIC开始洗脱。

决心

反相色谱是分辨率最高的色谱技术，而HIC的分辨率较RPC低。

应用

RPC主要用于蛋白质、多肽和寡核苷酸的分离，HIC主要用于蛋白质的纯化。

结论

反相色谱是一种在高疏水性条件下工作的分辨率最高的色谱技术。但是，HIC在中等疏水条件下工作。RPC和HIC是两种基于疏水性的分离技术。RPC和HIC的主要区别在于每种技术中使用的疏水性程度。

引用

1.疏水作用和反相色谱：原理和方法。GE Healthcare，2006年。可在此处获取