Illumina测序是下一代测序方法，又称“合成测序法”。Illumina测序涉及并行处理数百万个片段。Illumina测序工作流程涉及的四个基本步骤是库准备、聚类生成、测序和数据分析，本文将对此进行进一步描述。

覆盖的关键领域

1.什么是Illumina测序-定义、事实、优势2.Illumina测序如何工作-Illumina测序过程：–文库准备–聚类生成–测序–数据分析

关键词：聚类生成、数据分析、照明测序、库准备、综合排序

什么是illumina测序(illumina sequencing)？

照明菌测序或合成测序技术是目前世界上应用最广泛的下一代测序技术。世界90%以上的测序数据是由Illumina测序生成的。它最初是由剑桥大学的Shankar Balasubramanian和David Klenerman开发的。1998年，他们创立了一家名为Solexa的公司，2007年，Illumina收购了Solexa，迅速改进了原有技术。因此，该方法也称为Solexa/Illumina测序法。Illumina测序的主要优点是它提供了高的无错误读取率。

illumina测序如何工作

Illumina测序涉及的四个步骤如下所述。

步骤1.库准备

• 测序文库是通过转座酶将DNA同时标记成200-600碱基对的短片段，然后将接合器连接到DNA短片段的3′和5′端来制备的。
• 额外的基序，如测序引物结合位点，索引，和一个区域，这是补充流动细胞寡核苷酸被添加到适配器两侧的减少周期扩增。标记和添加的主题如图1所示。

Figure 1: Tagmentation and Addition of Motifs

步骤2.集群生成

• 将制备的测序文库变性后装入流式细胞中进行聚类生成。在产生簇的过程中，测序文库中的每个片段都是等温扩增的。流动池是由玻璃组成的。每条泳道都涂有两种寡核苷酸。一种类型与所制备文库的附加基序的5′区互补，另一种类型与所制备文库的附加基序的3′区互补。因此，这些寡核苷酸结合到测序文库中相应的DNA区域。含有两种寡核苷酸的流动细胞如图2所示。与测序文库5′区结合的寡核苷酸呈粉红色，而与测序文库3′区结合的寡核苷酸呈绿色。

Figure 2: Flow Cell

• 一旦单链测序文库与寡核苷酸结合，DNA聚合酶就会产生互补链。然后，所得的双链DNA被变性，原链被冲走。
• 片段的克隆扩增是通过桥扩增实现的。在这个过程中，股折叠在流动细胞的第二类低聚物上。然后，聚合酶合成双链桥。桥的变性导致两条DNA链：流动细胞寡核苷酸上的正向和反向链。
• 桥联扩增是一次又一次的重复，通过克隆扩增，在测序文库中同时获得数百万簇各种类型的片段。克隆扩增如图3所示。

Figure 3: Clonal Amplification

• 然后反向股被冲走，只保留流动细胞上的正向股。在前股中，3′端是自由的，它被阻塞以防止不必要的启动。

步骤3.排序

反向序列的第一次读取

• 测序始于第一个测序引物的扩展。Illumina测序方法采用了修饰的dNTPs，其中含有脱氧核糖糖3′位置的终止剂。这些dNTPs也被荧光标记为不同的颜色。
• 在每个互补核苷酸加入后，观察流动细胞中的簇状物以发射荧光。
• 在检测到光后，荧光团可以被冲掉。
• 然后，糖3′位的终止基团由羟基再生，允许在生长链中添加第二个dNTP。这个过程被称为合成测序。合成排序如图4所示。

Figure 4: Sequencing-by-Synthesis

• 在合成完成时，获得反向序列的第一个读数，并洗去测序产物。

索引1读取

• 然后将索引1引物与簇杂交，以相同的方式通过合成测序产生第二个读数。测序产物被冲走。

索引2读取

• 然后将簇的3′端脱保护，使3′端与流动细胞上的第二种寡核苷酸杂交（绿色）。由此，得到指数2区域的序列。测序产物被冲走。

正向序列的第二次读取

• 第二种寡核苷酸通过聚合酶延伸，形成双链桥。桥变性，3′端堵塞。前股被冲走了。
• 通过第二测序引物的杂交和延伸，通过合成测序获得正向序列的第二读取。

步骤4.数据分析

• 通过排序获得的数十亿次读取是根据它们的索引序列进行分组的。
• 然后，对具有相似读取的序列进行聚类。
• 正向和反向读取配对以形成连续序列。
• 模糊比对可以通过成对序列来解决。
• 相邻序列与参考基因组对齐以进行变体鉴定。

下面的视频解释了Illumina测序的完整过程。

结论

Illumina测序是下一代测序方法。Illumina测序涉及到一个200-600碱基对长片段DNA序列库的制备。Illumina测序涉及的四个步骤是库准备、聚类生成、排序和数据分析。由于Illumina测序具有较高的精度，因此是目前世界上应用最广泛的测序方法。

引用

1.“合成测序（SBS）技术。” 测序技术|合成测序，这里提供。