测序是测定特定DN**段核苷酸序列所涉及的过程。测序过程中，用荧光标记核苷酸对DN**段进行PCR标记。这一过程使用四种荧光标记核苷酸，它们是二氧基核苷酸（ddNTPs）。ddNTPs缺乏一个3′OH基团，其中磷酸群的传入核苷酸是连接。因此，当ddNTP加入生长链时，链的3′端不再添加核苷酸。这意味着在增长链中添加ddNTP终止了链增长。由于ddNTPs以低浓度加入PCR混合物中，因此每个生长链在不同水平终止。检测荧光发射，以确定PCR末端DN**段的核苷酸序列。

覆盖的关键领域

1.什么是DNA测序-定义，类型2.DNA测序如何工作-DNA测序过程

关键词：双脱氧核苷酸（ddNTPs），荧光标记，凝胶电泳，下一代测序，核苷酸序列，PCR，Sanger测序

什么是dna测序(dna sequencing)？

DNA测序是一种实验室技术，用于测定特定DNA分子的核苷酸序列。它使用荧光标记的核苷酸，这些核苷酸在PCR过程中被合并。基于荧光检测技术的测序方法主要有两种：Sanger测序和下一代测序。

双脱氧测序法

Sanger测序是由fredricsanger于1975年开发的第一种测序方法。它也被称为链终止法，因为它涉及到在体外DNA合成过程中选择性掺入链终止的ddNTPs。在Sanger测序中，扩增子通过凝胶电泳分离。Sanger测序技术广泛应用于DNA克隆片段和PCR扩增片段的测序。确定的DNA序列如图1所示。

Figure 1: DNA Sequencing

下一代测序

最新的DNA测序技术统称为下一代测序技术。这也是一种链终止方法。下一代测序使用毛细管电泳分离不同长度的扩增子，这些扩增子是通过链终止法产生的。下一代测序用于测定每次运行的大量核苷酸，例如在基因组测序中。

dna测序是如何工作的

在DNA测序过程中，荧光标记的核苷酸通过PCR加入到特定的DN**段中。为了延长DNA链，使用常规脱氧核苷酸（dNTPs）。然而，ddNTPs被添加到反应混合物中，这是荧光标记的。由于ddNTPs在脱氧核糖糖分子中没有3′OH基，因此可能不会发生进一步的链增长，从而终止链增长。脱氧核糖糖的3′OH基和核苷酸的磷酸基之间形成磷酸二酯键，形成DNA的糖磷酸骨架。但ddNTPs的添加浓度较低；因此，它们不会立即终止链增长。

将四种类型的DDNTP添加到四种不同的PCR混合物中。通过添加ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP进行四种不同的PCR反应。因此，在每个反应混合物中，链增长分别终止于A、G、C和T核苷酸。例如，在添加ddATP的反应混合物中，不同扩增子的生长在DN**段中的每个核苷酸处终止。通过Sanger测序确定DNA序列如图2所示。

Figure 2: Sanger Sequencing

四种核苷酸中的每一种都用单独的荧光色标记；ddATP用绿色染料标记；ddGTP用黄色染料标记；ddCTP用蓝色标记；ddTTP用红色染料标记。因此，四个PCR反应的扩增子用不同的颜色标记。

扩增出感兴趣的DN**段后，通过凝胶电泳或毛细管电泳分离扩增子。DN**段的核苷酸序列可以通过检测发射荧光来确定。通过Sanger测序可以很容易地确定750-1000碱基对长片段的核苷酸序列。然而，由于基因组中有大量的核苷酸，整个基因组的核苷酸序列的测定仍然具有挑战性。然而，下一代测序技术如454测序，每次运行可读取约2000万个碱基对。

结论

DNA测序是一种用于DN**段核苷酸序列测定的分子生物学技术。在测序过程中，通过PCR将荧光标记的核苷酸添加到DN**段中。通过检测发射荧光，可以确定核苷酸序列。

引用

1.“DNA测序。” 可汗学院，这里有。