DNA测序是一种有助于确定特定DNA分子核苷酸序列的技术。测序的两种方法是Sanger测序和下一代测序。这两种测序方法都是完全自动化的。任何DNA链都由四个核苷酸组成：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。在这两种测序方法中，DN**段中的核苷酸都用四种不同的荧光标记标记。荧光标记或荧光团是能够吸收光并以明确定义的波长发射光的分子。荧光标记通过PCR被整合到DNA链中。然后通过自动化技术确定核苷酸序列。

覆盖的关键领域

1.什么是测序-定义，Sanger测序，下一代测序2.荧光标记如何帮助确定核苷酸序列-测序程序

关键词：双脱氧核苷酸（ddNTPs），荧光标记，凝胶电泳，下一代测序，核苷酸序列，PCR，Sanger测序

什么是排序(sequencing)？

测序是一种实验室技术，用于测定DNA分子的核苷酸序列。两种主要的DNA测序方法可以被确定为Sanger测序和下一代测序。Sanger测序和下一代测序都使用带荧光标记的核苷酸来测定核苷酸序列。

双脱氧测序法

Sanger测序是最早发展起来的DNA测序方法。测序方法最早由fredricsanger于1975年提出，因此被称为Sanger测序。Sanger测序法也被称为链终止法，因为它涉及到DNA聚合酶在体外DNA合成过程中选择性掺入链终止双脱氧核苷酸（ddNTPS）。DNA链的延伸是由规则的脱氧核苷酸（dNTPs）实现的。然而，ddNTPs被添加到反应混合物中以终止链增长。这些DDNTP是荧光标记的。将四种DDNTP添加到四种不同的PCR混合物中。因此，通过添加ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP进行四种不同的PCR反应。在每个反应混合物中，链增长分别终止于每个A、G、C和T核苷酸。例如，在添加ddATP的反应混合物中，不同扩增子的生长在DN**段中的每个核苷酸处终止。然后，用凝胶电泳分离这四个反应，用荧光计扫描分离出的荧光。Sanger测序技术被广泛应用于DNA克隆和PCR扩增片段序列的测定。确定的核苷酸序列如图1所示。

Figure 1: DNA Sequences

下一代测序

最新的DNA测序技术统称为下一代测序技术。测序反应一次在芯片上进行。因此，几个测序反应是并行进行的。在下一代测序中，除了凝胶电泳外，毛细管电泳还用于分离链终止法产生的不同长度的amlic***。毛细管电泳是一种基于分子的电泳迁移率来分离分子的分析分离方法。

荧光标记如何帮助确定核苷酸序列

在测序过程中，被测序的DNA作为PCR合成DNA的模板链。DNA引物用于DNA聚合酶启动DNA合成。四种碱基的混合物（dNTPs；dATP、dGTP、dCTP、dTTP）和低水平的四种双脱氧核苷酸（ddNTPs；添加ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP）作为PCR反应的组分。因此，通过添加四种DDNTP中的每一种来执行四个单独的PCR反应。双脱氧核苷酸具有两个特殊特性：

1. 它们缺少3'-OH基团，DNA聚合酶将进入的核苷酸加入其中。因此，ddNTP的加入终止了链的生长。
2. 它们用不同的荧光染料标记：ddATP用绿色染料标记，ddGTP用黄色染料标记，ddCTP用蓝色标记，ddTTP用红色染料标记。

但是，链终止的ddNTPs的添加浓度较低；它们不会立即终止整个PCR过程。但是，当四个DDNTP中的一个被纳入到生长链中时，这个特定的链生长就终止了。因此，在每四个PCR反应结束时，产生一系列扩增子（PCR产生的DN**段），这些扩增子终止于靶DN**段的每个核苷酸。这些放大器可以在凝胶中运行。荧光染料通过电泳凝胶的一个特定点，可以通过荧光计进行扫描，以便在自动DNA测序仪中确定核苷酸序列。在DNA测序中获得的荧光标记核苷酸序列如图2所示。

Figure 2: Fluorescent-Labeled Nucleotide Sequence

通过组合序列中的每个核苷酸，可以确定初始DN**段的核苷酸序列。一个750-1000碱基对的片段的核苷酸序列可以很容易地通过Sanger测序来确定。然而，由于存在大量核苷酸，整个基因组的测序仍然具有挑战性。454测序是下一代测序的一种，通过这种测序，每次运行可以读取2000万个碱基对。

结论

测序是一种用于测定特定DN**段核苷酸序列的技术。桑格测序和下一代测序是两种主要的测序技术。这两种技术都使用荧光标记来测定核苷酸序列。四个链端接双氧基核苷酸分别用四种不同的荧光染料标记，并分别用四种PCR反应获得序列。

引用

1.亚当斯，吉尔DNA测序技术〉，《自然新闻》，自然出版集团，这里提供。2.卡尔，史蒂文M。荧光测序，这里提供。3.“DNA测序-荧光染料自动测序”，JRank文章，可在这里获得。 2.卡尔，史蒂文M。荧光测序， 3.“DNA测序-荧光染料自动测序”，JRank文章，