雙脫氧測序法(sanger sequencing)和焦測序(pyrosequencing)的區別
DNA測序對於DNA分析是非常重要的，因為在特定的DNA區域正確的核苷酸排列可以揭示許多重要的信息。有不同的DNA測序方法。Sanger測序和焦磷酸測序是分子生物學中廣泛應用的兩種不同的DNA測序方法。Sanger測序和Pyrosequencing的關鍵區別在於Sanger測序使用雙脫氧核苷酸終止DNA合成來讀取核苷酸序列，而PyroSequence則通過結合核苷酸和合成互補序列來檢測焦磷酸鹽的釋放，從而讀取順序。
內容1。概述和主要區別2。什麼是Sanger sequencing 3。什麼是火焰隔離4。並排比較——桑格測序與熱解測序5。摘要
什麼是雙脫氧測序法(sanger sequencing)？
Sanger測序是Frederick Sanger和他的學院於1977年開發的第一代DNA測序方法。它也被稱為鏈終止測序或雙脫氧測序，因為它是以雙脫氧核苷酸（ddNTPs）終止鏈為基礎的。在新一代測序（NGS）出現之前，這種方法被廣泛應用了30多年。Sanger測序技術能夠發現正確的核苷酸順序或特定DN**段的附著。它的基礎是在體外DNA複製過程中選擇性地摻入ddNTPs和終止DNA合成。鄰接的核苷酸之間形成一個獨特的特徵，即二硝基-3-磷酸酯的形成。因此，一旦ddNTP被連接，鏈延伸停止並從該點終止。桑格測序中使用了四種ddntp-ddtp、ddCTP、ddGTP和ddTTP。當這些核苷酸與DNA的生長鏈結合在一起時，它們會阻止DNA的複製過程，並導致不同長度的短DNA。毛細管凝膠電泳用於將這些短DNA鏈按其大小排列在凝膠上，如圖01所示。
圖1：合成短DNA的毛細管凝膠電泳
對於DNA的體外複製，應提供很少的要求。它們是DNA聚合酶酶、模板DNA、寡核苷酸引物和脫氧核苷酸（dNTPs）。在Sanger測序中，DNA複製與四種ddntp分別在四個獨立的試管中進行。脫氧核苷酸並沒有被相應的ddntp完全取代。特定dNTP（例如：dATP+ddATP）的混合物包含在試管中並複製。四種不同的管產品在四個單獨的油井中的凝膠上運行。然後，通過讀取凝膠，可以構建如圖02所示的序列。
圖02：桑格測序
Sanger測序是一項重要的技術，在分子生物學的許多領域都有幫助。利用Sanger測序方法成功地完成了人類基因組計劃。Sanger測序還可用於靶DNA測序、癌症和遺傳病研究、基因表達分析、人類鑑定、病原體檢測、微生物測序等。
桑格測序有幾個缺點：
- 測序的DNA長度不能超過1000個鹼基對
- 一次只能測序一條鏈。
- 這個過程既耗時又昂貴。
因此，隨著時間的推移，新的高級測序技術被開發出來以克服這些問題。然而，Sanger測序仍然在使用，因為它的結果非常精確，大約有850個鹼基對長度的片段。
什麼是焦測序(pyrosequencing)？
焦磷酸測序是在“合成測序”的基礎上發展起來的一種新的DNA測序技術。這項技術依賴於核苷酸摻入檢測焦磷酸鹽釋放。該過程採用四種不同的酶：DNA聚合酶、ATP磺酰化酶、熒光素酶和apyrase以及兩種底物腺苷5'磷酸硫酸酯（APS）和熒光素。
這個過程從引物與單鏈DNA模板結合開始，DNA聚合酶開始與之互補的核苷酸的結合。當核苷酸結合在一起（核酸聚合），它釋放焦磷酸鹽（兩個磷酸基團結合在一起）基團和能量。每次核苷酸的加入都會釋放等量的焦磷酸鹽。在底物APS存在下，焦磷酸鹽通過ATP磺酰化酶轉化為ATP。生成的ATP驅動熒光素酶介導的熒光素酶轉化為氧化熒光素，產生的可見光與ATP的量成正比。光被光子探測裝置或光電倍增管探測，併產生一個熱釋光圖。Apyrase降解反應混合物中的ATP和未結合的dNTPs。一次添加一次dNTP。由於核苷酸的加入是根據光的摻入和檢測而知道的，所以可以確定模板的序列。如圖03所示，熱解圖用於生成樣本DNA的核苷酸序列。
焦磷酸測序在單核苷酸多態性分析和短片段DNA測序中具有重要意義。焦磷酸測序比桑格測序技術具有高精度、靈活性、易於自動化和並行處理等優點。
圖03：焦測序
雙脫氧測序法(sanger sequencing)和焦測序(pyrosequencing)的區別
| 桑格測序與焦測序 | |
| Sanger測序是一種基於DNA聚合酶選擇性結合ddNTPs和鏈終止的DNA測序方法。 | 焦磷酸測序是一種基於檢測核苷酸釋放焦磷酸鹽的DNA測序方法。 |
| ddNTP的使用 | |
| ddNTPs用於終止DNA複製 | 不使用DDNTP。 |
| 涉及的酶 | |
| 使用DNA聚合酶。 | 使用了四種酶：DNA聚合酶、ATP磺酰化酶、熒光素酶和Apyrase。 |
| 使用的基板 | |
| 不使用APS和熒光素。 | 使用5'磷酸腺苷（APS）和熒光素。 |
| 最高溫度 | |
| 這是一個緩慢的過程。 | 這是一個快速的過程。 |
總結 - 雙脫氧測序法(sanger sequencing) vs. 焦測序(pyrosequencing)
Sanger測序和焦磷酸測序是兩種用於分子生物學的DNA測序方法。Sanger測序通過終止鏈的延伸來構建核苷酸的順序，而焦磷酸測序則通過結合核苷酸和檢測焦磷酸鹽的釋放來構建核苷酸的精確順序。因此，焦桑格測序和焦桑格測序之間的區別在於測序是通過測序終止的。
參考文獻：1。Fakruddin，醫學博士和Abhijit Chowdhury。“焦磷酸測序是傳統桑格測序的一種替代品”，《美國生物化學與生物技術雜誌》。科學出版物，2012年3月2日。網狀物。2017年2月28日。“桑格測序”。桑格測序-科學指導主題。N、 p.，N.d.網絡。2017年2月28日
