生物技术研究的一个重要组成部分是利用蛋白质工程技术来设计或修饰蛋白质。这些蛋白质纯化技术优化了特定工业应用的蛋白质特性。

这些技术要求科学家分离和纯化感兴趣的蛋白质，以便研究它们的构象和底物特异性。还需要研究与其他配体（一种附着于受体蛋白的蛋白质）的反应以及特定的酶活性。

所需的蛋白质纯度取决于蛋白质的预期最终用途。对于某些应用，粗提取物就足够了。其他用途，如食品和药品，需要高纯度。为了达到所需的纯度水平，使用了几种蛋白质纯化技术。

制定战略

每个蛋白质纯化步骤通常会导致某种程度的产物损失。因此，理想的蛋白质纯化策略是以最少的步骤达到最高的纯化水平。

选择使用哪些步骤取决于目标蛋白质的大小、电荷、溶解度和其他性质。以下技术最适合纯化单个胞浆蛋白。

胞浆蛋白复合物的纯化更为复杂，通常需要采用不同的方法。​

制备粗提取物

纯化细胞内（细胞内）蛋白质的第一步是制备粗提取物。提取物将包含来自细胞质的所有蛋白质的复杂混合物，以及一些额外的大分子、辅助因子和营养素。

这种粗提取物可用于生物技术的某些应用。但是，如果纯度存在问题，则必须遵循后续纯化步骤。粗蛋白质提取物是通过去除细胞裂解产生的细胞碎片来制备的，细胞裂解是通过使用化学品、酶、超声波或法国压榨机来实现的。

清除萃取物上的碎屑

通过离心去除碎片，并回收上清液（固体残留物上方的液体）。细胞外（细胞外）蛋白质的粗制备可通过离心简单地去除细胞获得。

对于某些生物技术应用，需要耐热酶，这种酶可以耐受高温而不变性，同时保持高比活性。

产生耐热蛋白质的生物体有时被称为极端微生物。纯化耐热蛋白质的一种简单方法是通过加热使混合物中的其他蛋白质变性，然后冷却溶液（从而使耐热酶在必要时重新溶解或重新溶解）。变性的蛋白质可以通过离心去除。

中间蛋白纯化步骤

现代生物技术协议通常利用许多商业上可获得的试剂盒或方法，为标准程序提供现成的解决方案。蛋白质纯化通常使用过滤器和制备的凝胶过滤柱进行。

按照透析试剂盒的说明，添加适当体积的适当溶液，并等待指定的时间长度，同时在新鲜试管中收集洗脱液（通过柱的溶剂）。

使用色谱法

色谱法可采用台式色谱柱或自动HPLC设备。HPLC分离可通过反相、离子交换或尺寸排除法完成，样品可通过二极管阵列或激光技术检测。​

利用降水

在过去，从粗提取物中纯化蛋白质的第二个常见步骤是在具有高渗强度的溶液（即盐溶液）中沉淀。蛋白质沉淀通常使用硫酸铵作为盐。粗提取物中的核酸可以通过沉淀硫酸链霉素或硫酸鱼精蛋白形成的聚集体来去除。

盐沉淀通常不会产生高纯度的蛋白质，但可以通过浓缩样品来帮助消除混合物中一些不需要的蛋白质。然后通过多孔纤维素管透析、过滤或凝胶排除色谱法去除溶液中的盐。

不同的蛋白质会在不同浓度的硫酸铵中沉淀。一般来说，较高分子量的蛋白质在较低浓度的硫酸铵中沉淀。

蛋白质可视化与纯化评价

反相色谱（RPC）根据蛋白质的相对疏水性（排除水中的非极性分子）分离蛋白质。该技术具有高度选择性，但需要使用有机溶剂。

一些蛋白质被溶剂永久变性，在RPC过程中会失去功能。因此，不建议所有应用都使用该方法，特别是如果目标蛋白需要保留活性的话。

离子交换

离子交换色谱是指基于电荷的蛋白质分离。柱可以用于阴离子交换或阳离子交换。阴离子交换柱包含一个带正电荷的固定相，吸引带负电荷的蛋白质。

阳离子交换和凝胶过滤

阳离子交换柱是反向的，带负电的珠子，吸引带正电的蛋白质。目标蛋白质的洗脱（从另一种材料中提取）通过改变柱中的pH值来完成，这导致每个蛋白质的带电官能团的改变或中和。

尺寸排除色谱法

尺寸排除色谱法（也称为凝胶过滤法）将较大的蛋白质从较小的蛋白质中分离出来，因为较大的分子在色谱柱中通过交联聚合物的速度更快。大的蛋白质不适合聚合物的孔，而小的蛋白质适合，并且需要更长的时间通过色谱柱，通过不太直接的路线。

洗脱时间

洗脱液（洗脱的结果）收集在一系列根据洗脱时间分离蛋白质的试管中。凝胶过滤是浓缩蛋白质样品的有用工具，因为目标蛋白质的洗脱体积小于最初添加到柱中的洗脱体积。由于其成本效益，类似的过滤技术可用于大规模蛋白质生产。

亲和层析和电泳

亲和层析是一种非常有用的“抛光”技术，或完成蛋白质纯化过程。色谱柱中的珠子与特异性结合到目标蛋白质的配体交联。

然后用含有游离配体的溶液冲洗，将蛋白质从柱中去除。与其他技术相比，该方法提供了最纯净的结果和最高的比活性。

sds-page

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠与聚丙烯酰胺凝胶电泳一起使用）与蛋白质结合，使蛋白质带上较大的净负电荷。由于所有蛋白质的电荷都相当相等，这种方法几乎完全根据大小来分离它们。

SDS-PAGE通常用于在一系列的每个步骤后测试蛋白质的纯度。随着不需要的蛋白质逐渐从混合物中去除，SDS-PAGE凝胶上可见的条带数量减少，直到只有一条条条带代表所需的蛋白质。

免疫印迹

免疫印迹技术是一种结合亲和层析的蛋白质可视化技术。特定蛋白质的抗体用作亲和层析柱上的配体。

目标蛋白保留在柱上，然后用盐溶液或其他试剂冲洗柱以去除。一旦目标蛋白与混合物的其余部分分离，与放射性或染料标签相连的抗体有助于检测目标蛋白。